【团体标准】 黄芪种子质量标准

1试验材料的来源黄芪种子于2018年5月至今，分别在山西省10个不同地区进行了种子收集。经中国医学科学院药用植物研究所王文全教授鉴定为黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的种子。种子产地信息见表1。表1蒙古黄芪种子的产地来源样品号来源1山西省小银厂村2山西省菜三子村3山西省马张村4山西省官儿村5山西省黄崖村6山西省长雨村7山西省平道村8山西省黑石村9山西省宋岭沟村10山西省土岭村2种子质量检测2.1种子检测流程图2.2扦样参照GB/T3543.2（农作物种子检验规程——扦样）进行扦样，种子批的最大重量按GB/T3543.2确定，送验样品和净度分析按GB/T2930.1确定，每批种子最大重量不得超过10000kg，净度分析最小重量20g，送验样品最小重量200g，容许差距为5%；若超过规定重量时，须另行划批，并分别给以批号。若小于或等于规定重量的1%时，称作小批种子。分取试验样品采用“徒手减半法”：将种子均匀地铺在清洁的台纸上；使用平边刮板将样品先纵向混合，再横向混合，重复混合4～5次，充分混匀；把种子堆分成两半，每一半再对分一次，分离得到均匀的四部分，把其中的每一部分半分成八个部分，排成两行，每行四个部分。合并和保留交错部分，把留下各部分拿开，将上一步保留的部分，再重复步骤分样，直至分得所需样品重量的左右为止。2.3种子净度分析蒙古黄芪种子净度分析中送检样品的最小重量为20g（至少含有2500粒种子）。送检样品的重量应超过净度分析量的10倍以上，至少200g。将每份试验样品按净种子、杂质分开，分别称重，以g表示，计算净种子的百分率。山西省不同地区的10份蒙古黄芪种子，均无其他植物种子，净度均在90%以上，各试样增失差距均没有偏离原始质量的5%，为有效数据。表2不同产地蒙古黄芪种子净度测定样品号试样重/g杂质重/g纯净种子重/g平均净度120.01251.120318.892294.40%220.02650.957919.068695.22%320.00391.858418.145590.71%420.01850.739519.279096.30%520.06352.461517.602087.73%620.01743.019216.998284.92%720.02450.992319.032295.04%820.01151.305618.705993.47%920.00661.191418.815294.04%1020.01101.147218.863894.27%10份黄芪种子试样均没有其他植物种子。使用此方法作净度分析，各试样增失差距均没有偏离原始质量的5%，所以此方法和程序切实可行。结果见表2。由表2可以看出，山西浑源蒙古黄芪种子的净度范围为84.92%～96.30%，10个不同地区黄芪种子的净度有明显差异。其中官儿村的黄芪种子净度最高，其值为96.30%；长雨村的种子净度最低，其值为84.92%。2.4种子硬实率测定取蒙古黄芪种子100粒，放置于培养皿中，加水，置25℃恒温培养箱中浸泡1d。没有明显膨胀的种子记为硬实种子，统计硬实种子数并计算硬实率，重复3次。硬实率=（硬实种子数/参试种子数）×100%。表3不同产地蒙古黄芪种子硬实率测定样品号硬实率（%）130.25236.45340.89438.26535.41629.86736.46833.56935.481032.19由于没有发芽的种子均为未吸涨的硬实种子。由表3可以得出，山西省地区的蒙古黄芪种子的硬实率在29.86～40.89%。其中样品6（山西省长雨村）的硬实率最低，低至29.86%。而样品3（山西省马张村）的硬实率最高,达到40.89%。2.5真实性鉴定采用种子外观形态法进行，从供试样品中随机数取100粒净种子，4次重复，在显微镜下逐粒观察种子的形态特征，并测定其长度、宽度。蒙古黄芪种子有褐色、黄褐色、黑色；形状有肾形、宽肾形、球状肾形和宽肾形；由表4可知不同产地的黄芪种子的大小有明显差异。总体大小在该范围内：长3.17～3.35mm，宽2.44～2.56mm，厚0.99～1.08mm（见表4）；黄芪种子的种皮带斑类型有3种，即点状斑，片状斑和无斑，这些特征可以作为蒙古黄芪种子与其他植物种子鉴别的主要形态特征。但是蒙古黄芪从种子形态、大小、颜色与膜荚黄芪非常相似，如果二者的种子在样品中混杂，则很难从种子外观形态上进行准确的鉴定，需采用幼苗形态来鉴。表4不同产地蒙古黄芪种子的长、宽和厚测量样品号长度/mm宽度/mm厚度/mm13.222.511.0223.172.491.0333.312.461.0343.192.280.9953.332.551.0763.302.561.0673.322.491.0583.352.441.0693.292.541.01103.202.561.022.6重量测定分别考察百粒法、五百粒法及千粒法，具体设计如下：①百粒法：随机从净种子中数取100粒，重复8次，分别记录百粒重，计算标准差及变异系数。②五百粒法：随机从净种子中数取500粒，重复3次，分别记录五百粒重，计算标准差及变异系数。③千粒法：随机从净种子中数取1000粒，重复2次，分别记录千粒重，计算标准差及变异系数。表5蒙古黄芪种子千粒重的方法考察样品号百粒法五百粒法千粒法百粒重/g标准差/g变异系数/%五百粒重/g标准差/g变异系数/%千粒重/g标准差/g变异系数/%17.0160.0610.8735.1440.0490.14356.8000.1510.0426.3410.0390.6231.6550.0710.22311.0460.1960.0636.3990.0510.8032.1460.0290.09329.9640.0890.0347.3410.0250.3436.7840.0840.23378.0360.1320.0357.3670.0130.1837.3360.0460.12372.3760.0730.0267.9950.0350.4440.9740.0220.05409.7360.0880.0278.0570.0270.3440.9840.0340.08413.8360.0640.0286.9600.0781.1235.3990.0500.14356.9860.1520.0497.3980.0851.1537.6720.0570.15372.9000.1440.04107.1230.0610.8635.2140.0240.07359.1360.0370.01试验通过百粒法、五百粒法、千粒法测定蒙古黄芪种子千粒重的研究结果表明（表5），不同方法测定蒙古黄芪种子重量变异系数均小于4.0%。综合比较3种方法，百粒重法所需种子量较少，故选择百粒重法作为蒙古黄芪种子千粒重的测定方法。2.7含水量测定参照GB/T3543.6-“农作物种子检验规程”水分测定执行。课题组前期研究中分别采用高温高恒温烘干法和低恒温烘干法对黄芪种子含水量进行测定。分别采用高恒温烘干法和低恒温烘干法进行测定。每个产地重复3次。表6两种烘干法对蒙古黄芪种子水分含量的影响样品号不同烘干方法下种子含水量（%）高恒温烘干法（4h）低恒温烘干法(16h)16.98±0.114bc6.76±0.157d27.68±0.058b7.52±0.088c36.63±0.076c6.34±0.074e48.01±0.161ab7.68±0.105ab58.25±0.101a8.02±0.089a68.52±0.054a8.49±0.047a77.00±0.086bc6.85±0.034d88.10±0.035a7.93±0.057ab97.41±0.112b7.25±0.108c107.98±0.104ab7.77±0.085b由表6可以得知，10个不同地区的黄芪种子的含水量存在明显的差异。蒙古黄芪种子用高恒温烘干法在1～3h内迅速失水，随后失水缓慢，在5～6h内无显著变化，且在4h后种子含水量前后差异以达到试验要求。在低恒温烘干16h后失水变化趋于平稳，且在17～19h内种子含水量无显著变化。综合4份蒙古黄芪种子含水量测定情况，高恒温烘干法选择烘干时间4h为宜，低恒温烘干法选择烘干时间以16h为宜（6表）。二者之间存在显著差异(P＜0.05)，可以认为低恒温烘干法无法完全排出种子内的游离水。另外，鉴于低恒温烘干法所需时间较长，因此选择高恒温烘干4h为蒙古黄芪种子含水量测定方法。2.8发芽试验（1）发芽前处理：称取蒙古黄芪种子10g，用砂纸轻轻打磨至蒙古黄芪种子表面失去光泽出现倒刺，以破除种子硬实。（2）发芽床的选择：根据蒙古黄芪种子特点，选择滤纸、纱布2种发芽床进行比较。每个处理重复3次，每次50粒种子。每12h记录一次发芽数。（3）发芽温度的选择：设20℃、25℃、30℃3个温度处理，每个处理3次重复，每次重复50粒种子。发芽床采用双层湿润滤纸，试验过程保持滤纸湿润，每12h记录种子发芽数。不同发芽温度下，蒙古黄芪种子发芽率表现出一定的差异。（4）发芽计数时间的确定：根据种子发芽情况，确定发芽开始和结束时间。以种子露白为发芽开始时间，以种子露白为发芽开始时间，每12h记录一次发芽数，连续3次记录无萌发种子出现为发芽结束时间。表7不同产地蒙古黄芪种子发芽率样品号滤纸床纱布床初次计数时间/h发芽时间（h）发芽率（%）初次计数时间/h发芽时间（h）发芽率(%)1127288.33127286.742127281.67127281.353127280.67127278.394127283.67127282.975127286.33127283.856127289.67127286.297127286.67127286.078127285.00127283.239127290.33127287.7710127286.67127282.45由表7可以得出使用滤纸来发芽的方法比使用纱布要好，其中9号样品（宋岭沟村）的发芽率最高，达到90.33%，而发芽率最低的3号样品（马张村）也达到了80.67%。而纱布床上，蒙古黄芪幼苗胚根深入纱布间隙，影响计数，鉴于滤纸床操作简单，观察清晰，选择滤纸床作为蒙古黄芪种子发芽床。而通过实验得出25℃、30℃种子发芽率和发芽势均较高，与20℃种子发芽率和发芽势达到显著水平（P＜0.05），但25℃、30℃之间差异不显著（P＞0.05）。当温度达到30℃时，种子易染霉菌，并且水分蒸发较快，故选择25℃作为蒙古黄芪种子发芽温度。实验表明当发芽试验到72h,连续3次记录无萌发种子出现，固黄芪种子以滤纸为发芽床的末次记数时间为72h。2.9生活力测定用氯化三苯基四氮唑TTC染色法。（1）预湿处理和种子胚的暴露方法：取净种子，破除硬实，浸种吸涨，将吸涨的种子剥皮。置于TTC溶液中避光染色。（2）染色时间、浓度和温度：采用3因素3水平L9（34）的正交试验设计。TTC染色时间为1h，3h，5h，TTC浓度设0.1%，0.3%，0.5%，培养温度为25℃，30℃，35℃。每个处理100粒种子，3次重复。染色结束后，沥去溶液，用清水冲洗3次，将裸种子摆在培养皿中。（3）染色鉴定标准的建立：有生活力蒙古黄芪种子的染色情况：胚完全着色；1/2胚根、1/3子叶末端或不超过子叶边缘总面积的1/3不染色，其余部分完全染色。不满足以上条件的均为无生活力种子。表8TTC不同处理对蒙古黄芪种子染色着色率的影响处理时间/h浓度/%温度/℃着色率/%110.12516.46e230.13086.23c350.13591.33b450.33093.83b510.33594.63b630.32582.00d730.53598.33a850.52586.67c910.53091.67b由表8可知，黄芪种子染色情况与染色的时间、浓度、温度均有密切联系。试验结果表明，处理7染色情况较其它组别好。固选择处理5，即染色3h，0.5%四唑浓度，35℃作为黄芪种子生活力检测的染色条件为宜。2.10种子健康状况测定2.10.1种子外部带菌检测从蒙古黄芪种子中各选取一份种子表面不消毒种子200粒，放入100mL锥形瓶中，加入20mL无菌水充分振荡，吸取悬浮液1mL，以2000r?min-1转速离心10min，弃上清液，再加入1mL无菌水充分震荡、悬浮。吸取悬浮液100μL均匀加到直径为9cm的PDA平板上，涂匀，重复4次。以无菌水为空白对照。接种后在25℃恒温箱中黑暗培养5～7d，观察记录种子带菌情况，计算带菌率。带菌率（%）=（带菌种子数/检测种子数）×1002.10.2种子内部带菌检测将黄芪种子用灭过菌的沙子在研钵中蹭破种皮，用3%NaClO浸泡3min，再用清水浸泡3～4h后。在超净工作台内，将种皮和种仁分开后用1%NaClO溶液浸泡种皮、种仁30s后，用无菌水冲洗3遍，将同一样本的整粒种子、种皮和种仁分别均匀摆放在直径为9cm的PDA平板上，每皿摆放20个种皮或种仁组织块，4次重复。25℃恒温箱黑暗条件下培养5～7d后观察记录，统计真菌种类、分离频率和带菌率。以打开皿盖保持和摆放种子基本相等时间的未接种种子的滤纸和PDA培养基作为该检测方法的空白对照。分离频率（%）=（某一分离物出现数/分离物出现总数）×100试验结果表明同一产地不同的10个地区的蒙古黄芪种子带菌率存在差异，浮动范围在8.77～15.38%内。种子的外部带菌、内部带菌基本都是真菌，主要有3类：链格孢菌、青霉菌和曲霉菌（表9）。表9蒙古黄芪外部带菌种子携带菌种类和分离频率样品号带菌率（%）孢子数量（孢子/粒）真菌种类和分离频率（%）链格孢属青霉属曲霉属18.960.12×103100——215.380.18×1056.893.2—312.840.23×104—100—414.660.20×105—79.321.7510.180.15×103100——613.310.17×104——100713.080.38×10417.1—82.988.770.27×103100——911.500.31×104——100109.530.11×103100——注：“—”表示未检测到3种子质量分级研究3.1黄芪种子质量指标检测试验根据从山西省10个不同地区收集到的10份蒙古黄芪种子用于种子质量等级划分研究，，分别对10份换气种子的长度、宽度、厚度、净度、百粒重、含水量、生活力和发芽率的测定结果进行统计分析（表10）。表10蒙古黄芪种子质量指标测定样品号长度（mm）宽度(mm）厚度（mm）净度(%)百粒重(g)含水量(%)发芽率(%)13.222.511.0294.407.0166.9888.3323.172.491.0395.226.3417.6881.6733.312.461.0390.716.3996.6380.6743.192.280.9996.307.3418.0183.6753.332.551.0787.737.3678.2586.3363.302.561.0684.927.9958.5289.6773.322.491.0595.048.0577.0086.6783.352.441.0693.476.9608.1085.0093.292.541.0194.047.3987.4190.33103.202.561.0294.277.1237.9886.67由表10中可以得出黄芪种子的各个指标：长度为3.17～3.35mm，宽度为2.28～2.56mm，厚度为0.99～1.06mm，种子净度为84.9～96.30%，百粒重为6.341～8.057g，含水量为6.63～8.52%，发芽率为78.39～90.33%，各质量检测指标变异范围明显不同。3.2黄芪种子质量等级划分根据上述试验结果，通常可以通过种子发芽率、净度、千粒重、含水量这4个主要指标对黄芪种子等级进行初步的确立，由于发芽率是黄芪发芽能力的最重要指标，是种子内在质量的反映，为种子等级划分的决定性指标。净度是反映黄芪商品性状的重要指标，适当提高净度标准有利于黄芪种子商品质量的整体提高。千粒重与种子的成熟度和饱满度密切相关，而种子含水量与种子贮藏条件有关。可以通过对这四个主要指标进行系统聚类分析。图1.山西省10个不同地区蒙古黄芪种子系统聚类分析由图1可以得出从图中可以看出10个不同地区的种子规律的分成了三个集群，其中样品2、3、4（菜三子村、马张村和官儿村），样品编号1（小银厂村），样品编号6、9、7、8、10和5（长雨村、宋岭沟村、平道村、黑石村、土岭村和黄崖村）分别聚到一块。以发芽率指标为分级第一参考指标，综合考虑净度、千粒重、含水量等指标，将种子分为三级（一级：样品编号1;二级：样品编号6、9、7、8、10和5；三级：样品编号2、3和4。根据系统聚类分析和方差分析结果表明，不同产地黄芪种子间发芽率、净度、千粒重差异显著（p＜0.05）。将山西省地区的蒙古黄芪种子划分为3类，即3个等级（见表11）。表11蒙古黄芪种子质量分级标准分级指标等级划分一等二等三等净度（%），≥959085千粒重（g），≥7.57.06.0发芽率（%），≥908580含水量（%）≦9.03.3黄芪种子质量等级标准试验验证根据黄芪种子质量初步分级结果，分别选择Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级种子进行盆栽试验，研究不同等级种子与黄芪药材植株生长的关系，侧面来验证种子分级的合理性。试验地点设在中国医学科学院药用植物研究所温室里，使用直径20cm×高25cm的塑料盆，盆栽基质使用沙土（1:1），每盆播种蒙古黄芪种子15粒，共设4个重复。生长三个月后进行采收后检测地上重、地下重、叶绿素含量以及相关根系指标。3.3.1不同等级蒙古黄芪种子种植1周的出苗情况和3个月后植株生长状况从图2中可以得出三个等级的黄芪种子出苗率都很高，但整体出苗率：一级>二级>三级。这与试验检测的发芽率情况相符。从图3中可以看出不同等级的黄芪植株3个月后的生长情况有显著的差异，其中一级的地上生物量显著好于其它两个等级。3.3.2不同等级黄芪植株收获后的生长、生理指标。表12.不同等级蒙古黄芪植株的生物量和叶绿素含量的方差分析表指标等级地上重（g）地下重(g)叶绿素(mg/g)一级0.521±0.062a0.489±0.044a57.701±1.683a二级0.518±0.056a0.453±0.119b55.433±2.273b三级0.475±0.032b0.389±0.042c56.867±1.045ab由表12可以得出，三个月采收后，不同等级的黄芪植株在各个指标上都表现出显著的差异性。一级种子得到的植株在生物量和叶绿素含量上都高于其他两个等级。生物量是可以用来衡量产量的一个标准，试验结果表明在今后的大规模种植时，一级种子种出来的黄芪在产量上也是有保障的。表13.不同等级蒙古黄芪植株根系指标的方差分析表等级根系总长（cm）根表面积（cm2）根粗（mm）根系体积（cm3）一级103.347±3.421a23.386±1.913a0.5022±0.012a0.2320±0.066a二级89.203±3.432b19.322±1.734b0.5026±0.025a0.2237±0.053a三级61.204±4.678c13.389±1.057c0.4969±0.037b0.1575±0.035b图4.不同等级蒙古黄芪植株根系扫描图结合表13与图4可以得出，不同等级黄芪植株的根系指标有显著的差异，其中一级的黄芪种子种出的植株根系发达程度显著高于其他两个等级，根系总长、根表面积和根系体积分高达103.347cm、23.386cm2和0.2320cm3,虽然根粗略低于等级二，但是可以充分说明其在相同的生境下，具有更强的生存能力，具有更好的吸收水分和营养物质的能力。这也侧面应证了本次种子分级的科学性和合理性。