【团体标准】 北柴胡种子质量标准

（一）标准适用范围本标准规定了北柴胡（BupleurumchinenseDC.）种子质量检验规程和分级。本标准适用于伞形科植物北柴胡（BupleurumchinenseDC.）种子质量分级标准的建立和应用（质量分级、栽培生产、市场交易等）。（二）标准制定的相关论据北柴胡种植生产中基本以种子作为繁殖材料，种子质量好坏直接影响北柴胡药材的产量和质量。为此需对北柴胡主要种植基地的种子使用情况进行调研和数据测定，开展北柴胡种子质量标准的研究。1.北柴胡种子样品收集2017年10月至2018年11月收集北柴胡种子36份，包括中柴2号品种在河北和北京不同产地和年份的种子，山西长治、运城、阳城、闻喜等柴胡产地的农户家和小商铺出售的种子。2.试验方法2.1扦样采用徒手减半法直接分取送验样品。步骤如下：将种子样品倒在光滑平面上，使用刮板将样品先纵向混合再横向混合，重复混合4次。然后将种子分成两份，每份再对分一次，得到4个部分。然后把每一部分再次分成两份，最终得到8个部分。合并和保留交错部分，把余下的4部分拿开。重复上述分样步骤，直至分得种子质量符合送验样品质量为止。2.2净度分析步骤如下：（1）称量送验样品总重，记为M。检查送验样品是否含重型混杂物，如土块、石块或在小粒种子中混有的大粒种子等。若有重型混杂物，将重型混杂物拣出并称重，记为m。然后从重型混杂物中分出其他植物种子和杂质，其他植物种子质量记为m1，杂质质量记为m2。（2）用分样板从拣出重型混杂物的送验样品中分取1份全试样（约含2500粒），称量试样质量。将试样倒在分析台上，将其中的净种子、其他植物种子和杂质分开。分离时可借助筛子筛理，筛子难以分离的物质经人工分离。然后将分开的各部分放入相应的容器内。（3）分别计算试样中净种子、其他植物种子及杂质的含量，分别记为P1，OS1，I1。计算时被除数为3种成分质量之和。三种成分质量之和不能大于原试样5%。计算各成分含量，计算公式如下：净种子（P2）：P2（%）=P1×(M-m)/M其他植物种子（OS2）：OS2（%）=OS1×(M-m)/M+m1/M×100杂质（I2）：I2（%）=I1×(M-m)/M+m2/M×100最后应检查：（P2+OS2+I2）=100.00%。修约：先检查各成分之和是否为100.0%，小于0.05%的误差可忽略不计。如果其和为99.9%或100.1%，那么从最低值中增减0.1%。如果修约值大于0.1%，则应检查计算有无误差。2.3重量测定材料为B-1～B-5，为中柴2号不同产地和年份的种子，分别为：2018年河北望都、2017年河北望都、2018年北京药植所栽培试验地、2017年北京药植所栽培试验地、2017年河北保定，净种子样本。我国农作物种子检验规程（GB/T3543.1～3543.7-1995）规定，种子千粒重测定方法有百粒法和千粒法。本试验用以上两种方法测定北柴胡种子千粒重，步骤如下：（1）百粒法：取B-1～B-5净种子，每份样品用百粒法测定其千粒重两次。即从每份样品中随机数取种子100粒，8次重复，分别称重；再重新数取种子100粒，8次重复，分别称重。称重结果精确至0.001g。计算每次百粒法的均值、标准差、变异系数。（2）千粒法：取B-1～B-5净种子，每份样品用千粒法测定其千粒重两次。即从每份样品中随机数取种子1000粒，2次重复，分别称重；计算均值、重复间差数；测定每份样品烘干后的重量，以计算实际含水量，以10%为规定含水量，计算规定水分条件下的千粒重。称重结果精确至0.001g。2.4水分测定试验材料为收集到的山西运城等各地种子的净种子。依据《农作物种子检验规程》，种子水分测定方法有高恒温烘干法和低恒温烘干法。本试验用以上两种方法测定北柴胡种子水分。高恒温烘干步骤如下：（1）分别取各份净种子5g，2个重复。（2）取洁净铝盒置于130℃烘箱内预先烘干1h。1h后取出铝盒，放进干燥器内冷却干燥30min。冷却后将铝盒称重，然后放入种子，称总重。（3）将铝盒放入130℃烘箱内，每隔0.5h取出铝盒放入干燥器内冷却，然后称重，直至累计烘干3h。（4）计算每次烘干后测得的种子水分。所有称重结果精确至0.001g。同一样品的重复间差距不能超过0.2%。低恒温烘干方法步骤与高恒温烘干一致，不同的是种子烘干温度为103℃，烘干时间为17h。2.5真实性鉴定取中柴2号、山西产北柴胡、三岛柴胡、银州柴胡和狭叶柴胡种子各400粒，用游标卡尺测量其长宽。然后将种子置于体式显微镜下观察，记录种子形态特征并拍照。2.6发芽试验研究了北柴胡适宜发芽床、适宜发芽温度、发芽试验初次计数时间和末次计数时间以及正常幼苗和不正常幼苗评定准则。发芽床选择：分别用砂中、纸上（双层滤纸下加0.5cm的海绵保湿）的方法进行发芽试验。每天统计发芽种子数，胚根长≥2mm，两片子叶长出记为发芽。发芽温度选择：用纸上（双层滤纸下加0.5cm的海绵保湿）发芽方法进行发芽试验，设置恒温15、20、25、30、变温15～25℃（25℃8h，15℃16h）、20～30℃(30℃8h，20℃16h)。每处理6次重复，每重复100粒种子。种子经自来水冲洗10min后，置床，放入培养箱发芽。萌动后每日记录萌动种子数，观察至第35d。每天统计发芽种子数。发芽试验计数时间：纸上发芽，变温25℃8h，15℃16h。每天统计发芽种子数。幼苗评定标准：发芽计数时间试验结束后，观察幼苗形态，结合《GB/T3543.1～3543.7-1995农作物种子检验规程实施指南》确定正常幼苗形态及不正常幼苗形态。1.2.7生活力测定研究四唑染色测定北柴胡种子生活力的方法，包括预湿方法、染色前处理、四唑溶液浓度和染色时间、染色形态鉴定标准。预湿方法：种子各400粒，分别放入15cm培养皿，加适量蒸馏水浸泡。观察种子吸水情况和种皮软化状况。染色前处理：北柴胡种子由种皮、胚乳和胚构成，染色前横向切去种子末端（果柄着生端）1/3～1/2，再沿中线纵向切成两半，取其中一半染色。四唑溶液浓度和染色时间：取中柴1号种子200粒，水浸预湿16h，做染色前处理。取4个洁净的9cm培养皿，各放50粒种子，倒入0.5%或1.0%的TTC溶液。每处理2次重复。30℃黑暗条件下染色。染色8h后，种子略显红色，此后每隔2h分别从0.5%和1.0%的TTC溶液中随机取20粒种子显微拍照，记录染色深浅程度，直至染色18h。染色形态鉴定：北柴胡种子凡胚乳切面和胚全部染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的为正常有生活力的种子；否则为无生活力的种子。染色形态鉴定：取中柴1号种子400粒，水浸预湿16h，做染色前处理。放入9cm培养皿内，每皿50粒，倒入0.1%，0.3%，0.5%，0.7%的TTC溶液，30℃黑暗条件下染色18h。染色结束后倒出并清洗种子表面残留的染色液，然后将种子置于体式显微镜下观察染色形态并分类，确定有生活力的种子形态及无生活力的种子形态，然后对其拍照。依据暂确定的染色形态鉴定标准判定种子生活力。随机数取8份种子各400粒，用上述方法测定其生活力。同时做纸上（双层滤纸下加0.5cm的海绵保湿）发芽试验，统计发芽率。分析所测生活力与发芽率的相关性，判断染色形态鉴定标准是否准确。3结果与分析3.1扦样和净度分析确定柴胡种子批的重量在1000kg以内，确定柴胡送验样品最小重量50g。送验样品的重量因检测项目的不同而异。送验样品的重量因检测项目的不同而异，由于用高温烘干法测定柴胡种子水分时不须要磨碎，用样量5g，确定柴胡送验样品最小重量50g，足以保证所有项目测定的需要。净度分析试样的大小估计至少含有2500个种子单位的重量，北柴胡种子千粒重大约1.1g，2500粒种子重量为（1.1×2500）/1000=3.0（g），确定柴胡净度分析试样的最小重量为6g。采用徒手减半法从每份柴胡样品中分取两份全试样，将试样分离成净种子、其他植物种子和一般杂质三种成分后分别称重，以g表示。将每份试样各成分的重量相加，计算各成分所占百分率，如果分析后重和原重的差异超过原重的5%，重新分析。试样称重和百分率计算的精确度参照国际种子检验规程。通过对不同来源的9份柴胡种子的净度分析可以看出，9份试样中有3份试样的净度在75%～80%，2份试样80%～90%，4份试样90%以上，各试样误差不超过2%（表1）。表1北柴胡样品净度Table1PurityofBupleurumchinenseseedsamples样品编号原重（g）净种子（g）其他种子（g）杂质（g）分析后重（g）净度（%）误差（%）CHHU01526.0964.5100.01731.4505.97775.52.0CHHU01536.1175.8610.04250.19736.10196.10.3CHHU01616.0024.7660.00201.2115.97979.70.4CHHU01626.0015.328-0.57365.90290.31.7CHHU01866.0015.577-0.36345.94193.91.0CHHU01876.0015.830-0.09665.92798.41.2CHHU01996.2045.0980.00451.0426.14483.01.0CHHU02006.0964.8180.00081.2066.02580.01.2注：“-”代表没有其它植物种子3.2千粒重用百粒法测定北柴胡不同种子批（中柴2号不同产区不同年份所产种子）重量，重复间变异系数大于4.0，结果不可靠，不能用于测定北柴胡种子千粒重（表2）。表2百粒法测定北柴胡种子千粒重Table2Determinationtheweightof1000seedsofBupleurumchinenseby100-seedsweight样品编号测定次数均值（g）标准差（S）变异系数(CV)变异系数是否小于4.0千粒重（g）B-1第1次0.11360.00383.3827是1.1359第2次0.1070.00333.1241是1.0704B-2第1次0.10850.00403.7181是1.0848第2次0.11210.00312.7531是1.1213B-3第1次0.12010.00453.7605是1.2009第2次0.12140.00262.1586是1.2141B-4第1次0.12770.00272.1107是1.2769第2次0.12660.00241.9116是1.2658B-5第1次0.12890.00493.7922是1.2885第2次0.12980.00483.6876是1.2983注：表中一次测定是指应用百粒法测定种子千粒重一次，即每次数取种子100粒，重复数取8次并称重。用千粒法测定北柴胡种子重量，重复间差数与均值之比小于5%，结果可靠，可用于测定北柴胡种子千粒重（表3）。表3千粒法测定北柴胡种子千粒重Table3Determinationtheweightof1000seedsofBupleurumchinenseby1000-seedsweight样品编号测定次数实测千粒重（g）均值（g）重复间差数/均值重复间差数/均值是否小于5%烘干后千粒重（g）千粒重（g）B-1第1次1.11181.11060.0022是1.03361.1480第2次1.1094是1.0328B-2第1次1.10051.09690.0066是1.03981.1500第2次1.0933是1.0302B-3第1次1.22371.22170.0033是1.15321.2801第2次1.2197是1.1510B-4第1次1.27551.27110.0069是1.10271.2716第2次1.2667是1.1861B-5第1次1.30831.30360.0072是1.22781.3563第2次1.2989是1.2136注：表中一次测定是指应用千粒法测定种子千粒重一次，即每次数取种子1000粒。千粒重（规定水分，g）=3.3水分测定用烘干减重法测定7份北柴胡种子水分含量变化，高恒温烘干条件下（130℃）测定种子的水分在前1.0h急剧丧失，1.0h后水分减重趋缓，1.5h基本保持不变（图1）。因此，高恒温烘干1.5h即可测定北柴胡种子水分。图1高恒温烘干法(130℃)测定北柴胡种子水分Figure1DeterminationofmoisturecontentofBupleurumchinenseseedsdryingat130℃比较高恒温烘干1.5h与低恒温（103℃）烘干17h的烘干效果，高恒温烘干法测定水分高于或基本持平低恒温烘干法，但每种方法测定各样品之间的含水量关系基本一致（图2）。图2不同烘干方法测定北柴胡种子水分Figure2ComparisonofmoisturecontentofBupleurumchinenseseedsdryingat130℃and103℃综上所述，采用130℃烘干1.5h测定北柴胡种子水分。3.4真实性鉴定柴胡属植物的种子为双悬果、椭圆形，侧面扁平，合生面收缩，表面棕褐色，略粗糙，悬果切面近半圆形或五边形，油管围绕胚乳四周，胚乳背面圆形，腹面平直，胚小。未见柴胡种子存在易混淆植物种子的报道。我们对三岛柴胡、银州柴胡（甘肃产区）、北柴胡（山西产区）和北柴胡品种中柴2号（北京产）的种子进行了观察。柴胡属不同种的种子间差别很小。银州柴胡和北柴胡的种子一般无鳞片，而三岛柴胡种子几乎全部有密批鳞片，中柴2号种子少部分有鳞片。银州柴胡种子呈短且厚的扁圆形，北柴胡种子细长、颜色深，而三岛柴胡和中柴2号种子粒大饱满、颜色相对浅。狭叶柴胡种子相比更为细长。柴胡为复伞形花序，分阶段成熟，种子外观又与种子的成熟度、植株上的着生部位、植株的生长年限、种子成熟的季节等有关，中柴2号不同产区采集的种子个体间存在颜色、大小、形状差异。整体上北柴胡（BupleurumchinenseDC.）种子长约3mm，宽约1mm，棕褐色或黑褐色，有棱，表面光滑或带鳞片，略弯曲成半月型。图3几种生产上常见的柴胡种子（三岛柴胡；银州柴胡；北柴胡；北柴胡品种“中柴2号”；狭叶柴胡）Figure3SeedsofBupleurumfalcatum,Bupleurumyinchowense,Bupleurumchinense,cv.ZhongchaiNo.2andBupleurumscorzonerifolium3.5发芽试验发芽床选择：北柴胡种子发芽慢，在双层滤纸发芽床上容易因有些种子带菌而影响发芽率统计，因此，比较了应用双层滤纸发芽床（根据菌的情况期间更换滤纸）（纸上方法）和砂床（砂中方法）两种发芽床测定发芽率的情况，如图4和图5。不同种子在两种发芽床上的发芽率表现略有不同，或基本一致，或略有差异，但明显用砂床可以避免菌污染问题。试验中发现基本所测的柴胡种子都存在较严重的菌污染问题，由此，尽管北柴胡种子属于小种子（理论上大多小种子适宜纸床），发芽试验适宜用砂床砂中方法。图4纸床和砂床北柴胡种子发芽率比较Figure4ComparisonofBupleurumchinenseseedgerminationonfilterpaperandinsand图5纸床（未更换滤纸和更换滤纸）及砂床上北柴胡种子发芽情况Figure5Bupleurumchinenseseedgerminationoncontinuouslyusedfilterpaper,onreplacedfilterpaperafter7daysandinsand发芽温度选择：发芽温度共6个处理：恒温15、20、25、30、变温15~25℃（25℃8h，15℃16h）、20~30℃(30℃8h，20℃16h)。每处理6次重复，每重复100粒种子。种子经自来水冲洗10min后，置床，放入培养箱发芽。萌动后每日记录萌动种子数(胚根长≥2mm时记为萌发)，观察至第35d（表3）。对于山西产北柴胡，与恒定发芽温度比较，采用15~25℃或20~30℃变温处理，显著促进种子发芽，同样变温条件下，北柴胡品种“中柴1号”的发芽率也很高，相比山西产北柴胡，中柴1号的发芽温度范围更广，适宜温度下，恒温和变温的发芽率均较高。综合，北柴胡的适宜发芽温度条件为：变温25℃8h，15℃16h或30℃8h，20℃16h。表4不同发芽温度条件下北柴胡种子的发芽率和发芽启动日天数Table4GerminationrateandthestartdateofBupleurumchinenseseedsatdifferenttemperatures发芽温度/℃北柴胡品种“中柴1号”北柴胡（山西产）发芽率（%）发芽启动日天数（d）发芽率（%）发芽启动日天数（d）1593.8a8ab14.9c14.2c2095.5a7.3b32.3b11c2591.9a6.7b25.1b17.8b3074.7b8.7a0.0d>35a15~2594.8a8ab77.0a11.8c20~3094.6a8ab76.3a12c注：表中发芽率数值后面的字母表示差异显著性(5%显著水平，采用修正最小显著差异法检测)，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡没有相同标记字母的即为差异显著。发芽试验初次计数时间和末次计数时间的确定：CH024（中柴2号）在第7天开始发芽，至第22天幼苗数量开始恒定不变；而其它种质（山西产）从第12天到15天开始发芽，至第35天幼苗数量基本恒定不变。北柴胡种子发芽动态见图6。综合考虑不同栽培种质样本，确定北柴胡种子发芽试验的初次计数时间为第7天，末次计数时间为第35天。图6北柴胡种子发芽率随时间变化图Figure6GerminationvariationofBupleurumchinenseseedswithtime正常幼苗和不正常幼苗评定标准：正常幼苗主根长，白色。有生活力的北柴胡种子发芽后大部分为正常幼苗，仅有少数幼苗为不正常幼苗，萌发幼苗形态见图7。北柴胡幼苗为子叶出土型幼苗。种子萌动后，胚根及下胚轴伸长，同时子叶脱去种皮并逐渐转绿。图7北柴胡正常（A）和不正常（B）的幼苗萌发Figure7Abnormal(AandB)andnormal(CandD)germinationofBupleurumchinenseseeds北柴胡幼苗的评定标准如下：正常幼苗：A完整幼苗：幼苗具有两片近狭长绿色子叶，胚轴完整且直立，主根较长，呈白色，幼苗整体健康而匀称。B有轻微缺陷的幼苗：幼苗部分子叶受损，其他部分正常，幼苗整体呈现健康匀称状态。C次生感染的幼苗：具有完整幼苗特征或有轻微缺陷，被细菌或真菌感染，但可以鉴别病原菌不是来自种子本身。不正常幼苗：A损失的幼苗：幼苗主根不伸长，仅有较短的根。B畸形幼苗：幼苗根系短小，子叶不能突破种皮；仅剩一片子叶且茎尖受损。C由于自身原因而腐烂的幼苗。3.6生活力测定预湿方法：预湿温度为20℃，北柴胡种子浸泡1.5h后吸收的水分就达到干种子重量的50%以上，浸泡21h后吸收的水分达到全部可吸收水分的90%以上，考虑1天的工作周期，确定柴胡种子的预湿时间为16h。染色前处理：北柴胡种子由种皮、胚乳和胚构成，染色前横向切去种子末端（果柄着生端）1/3～1/2，再沿中线纵向切成两半，取其中一半染色。四唑溶液浓度和染色时间：北柴胡种子在不同浓度的四唑溶液中染色深浅不同。在0.1%和0.3%TTC溶液中种子略显红色；在0.5%的TTC溶液中染成有光泽的红色；在0.7%TTC溶液中为深红色。所以使用0.5%的TTC溶液染色。北柴胡种子在0.5%的TTC溶液中随染色时间增加染色逐渐加深，30℃温度下染色18h后，胚乳切面和胚全部染成有光泽的鲜红色。染色形态鉴定：北柴胡种子凡胚乳切面和胚全部染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的为正常有生活力的种子；否则为无生活力的种子。图8北柴胡种子染色形态Figure8BupleurumchinenseseedsdyedbyTCC经验证，上述方法所测生活力和发芽试验所测发芽率呈较明显线性相关关系，见图9。所以此判定标准准确可靠。图9生活力与发芽率相关性Figure9Correlationofviabilityandgerminationrate4.北柴胡种子质量分级标准的研究选定种子样品的净度、千粒重、水分和发芽率作为种子质量分级的指标。4.1净度测定北柴胡种子净度变化范围为49.50%～97.80%，平均值为81.32%，其中有1份种子净度小于50.00%，4份净度大于90.00%（表5）。表5北柴胡种子样品净度Table5PurityofBupleurumchinenseseedsamples样品编号净度增失差样品编号净度增失差CHSZ677.91%0.01%ZC2-382.00%0.00%CHSZ278.16%0.01%CHSZ1297.80%0.00%CHSZ768.94%0.01%CHSZ1083.80%0.00%CHSZ572.64%0.01%CHSZ1182.20%0.00%CHSZ487.95%0.00%CHSZ1357.20%0.00%CHSZ149.50%0.00%CHSZ2075.80%0.00%CHSZ395.00%0.00%CHSZ1489.60%0.00%ZC2-189.00%0.00%CHSZ1593.80%0.00%ZC2-295.70%0.00%CHSZ1686.70%0.00%4.2千粒重测定北柴胡种子千粒重变化范围为0.673g～1.4765g，平均值为1.043g。有9份种子千粒重小于1.00g，7份种子千粒重小于0.9g，1份种子千粒重小于0.8g之间（表6）。表6北柴胡种子样品千粒重Table6Theweightof1000seedsofBupleurumchinenseseedsamples样品编号千粒重（g）样品编号千粒重（g）CHSZ60.84ZC2-31.224CHSZ21.03CHSZ121.4765CHSZ70.935CHSZ100.673CHSZ51.116CHSZ110.8585CHSZ41.225CHSZ131.2545CHSZ10.982CHSZ200.8745CHSZ31.222CHSZ140.806ZC2-11.196CHSZ150.865ZC2-21.309CHSZ160.8854.3水分测定北柴胡种子水分变化范围为5.52%～13.84%，平均值为8.035%，有2份种子含水量大于13.00%，14份种子含水量小于9.00%（表7）。表7北柴胡种子样品水分Table7MoisturecontentofBupleurumchinenseseedsamples样品编号含水量（g）样品编号含水量（g）CHSZ68.3ZC2-37.01CHSZ29.55CHSZ126.06CHSZ78.3CHSZ106.72CHSZ57.95CHSZ116.31CHSZ413.2CHSZ136.3CHSZ111.15CHSZ206.54CHSZ37.85CHSZ145.52ZC2-17.24CHSZ156.41ZC2-213.84CHSZ166.384.4发芽率测定北柴胡种子样品发芽率的变化范围为36%～88%，平均值为61%。其中有3份种子发芽率大于80%，3份种子发芽率小于50%，8份种子发芽率大于60%（表8）。表8北柴胡种子样品发芽率Table8GerminationrateofBupleurumchinenseseedsamples样品编号发芽率（g）样品编号发芽率（g）CHSZ671ZC2-388CHSZ255CHSZ1254CHSZ736CHSZ1053CHSZ572CHSZ1154CHSZ456CHSZ1361CHSZ149CHSZ2064CHSZ344CHSZ1467ZC2-185CHSZ1556ZC2-287CHSZ16514.5种子质量分级根据试验结果得到的北柴胡种子质量分级见表9。表9北柴胡种子质量分级Table9SeedqualitygradingofBupleurumchinense等级发芽率%千粒重g水分%净度%1≥75≥1.10≤9≥96263～75≥1.00≤993～96352～63≥0.90≤990～93