【团体标准】 花椒麻味物质含量的测定-液相色谱质谱法

3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1花椒制品花椒经粉碎、萃取、冷冻等工艺生产的产品。主要包括花椒粉、花椒油、保鲜花椒、花椒油树脂等以花椒为原料加工的产品。3.2花椒酰胺花椒呈麻味的主要成分，含有羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素和羟基-ε-山椒素等多种酰胺类成分。4原理花椒麻味物质主要包括羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素和羟基-ε-山椒素等多种酰胺类组分，试样中的花椒酰胺类组分经甲醇提取后，通过C18液相色谱柱的分离，采用SHIMADZULC-MS8050系统对色谱分离得到的物质进行识别和确认，利用270nm处紫外检测峰面积外标法对花椒麻味物质进行测定。色选机基本要求5试剂材料与仪器设备5.1试剂材料5.1.1甲醇：色谱纯。5.1.2乙腈：色谱纯。5.1.3冰醋酸：分析纯。5.1.4水：纯净水。5.1.5羟基--α-山椒素标准品：纯度大于95%。5.1.6微孔滤膜：孔径0.2um有机相滤膜。5.2仪器设备5.2.1液相色谱-三重四级杆质谱联用仪：LCMS8050日本SHIMADZU公司。5.2.2色谱柱：Shim-packGISTC18柱（2.1×50mm,2μm）5.2.3超声波清洗机：SB-4200DTD型宁波新芝生物科技有限公司。5.2.4分析天平：感量0.0001g。5.2.5高速粉碎机：转速≥10000rpm。5.2.6高速离心机：≥4500rpm。6仪器参考条件6.1色谱条件采用SHIMADZUShim-packGISTC18（2.1×50mm,2μm）色谱柱，流动相甲醇（A）-0.2%醋酸（B）二元高压梯度洗脱，SPD-M20A检测器，检测波长为254nm，流速为0.4mL/min，柱温为40℃。6.2质谱条件采用SHIMADZULC-MS8050系统对色谱分离得到的物质进行识别和确认。所有数据采集和处理步骤均采用Labsolution工作站进行。7实验步骤7.1标准溶液的配制准确称取羟基-α-山椒素10mg（精确至0.01mg），用甲醇溶解并转移至10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得每1mL含1mg羟基-α-山椒素的对照品储备溶液；准确吸取上述储备溶液1mL置10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.1mg羟基-α-山椒素对照品使用溶液（现配现用）。用色谱级甲醇稀释制成浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的对照品工作溶液。可根据仪器灵敏度适当调整浓度范围。7.2样品液制备7.2.1干花椒取混合均匀的花椒粒100g，用高速粉碎机粉碎后过20目筛，混匀。称取1g（精确至0.0001g）粉碎混匀后的样品置于具塞烧瓶中，加甲醇50mL，超声萃取0.5h，冷却至室温，转移至100mL容瓶，甲醇定容，移取上清液10mL于50mL容量瓶定容，经0.2μm滤膜过滤，待测。7.2.2鲜花椒取混合均匀的鲜花椒粒200g。经组织捣碎机捣碎后，称取5g(精确至0.0001g）粉碎混匀后的样品置于具塞烧瓶中，加甲醇50mL，超声萃取0.5h，冷却至室温，转移至100mL容瓶，甲醇定容，移取上清液10mL于50mL容量瓶定容，经0.2μm滤膜，待测。7.2.3花椒粉称取1g(精确至0.0001g）粉碎混匀后的样品置于具塞烧瓶中，加甲醇50mL，超声萃取0.5h，冷却至室温，转移至100mL容瓶，甲醇定容，经0.22μm滤膜过滤，待测。7.2.4花椒油花椒油摇匀，精密称取0.2g（精确至0.0001g）置于具塞烧瓶中，加甲醇50mL，超声萃取0.5h，冷却至室温，转移至100mL容瓶，甲醇定容，0.22μm滤膜过滤，待测。7.2.5花椒油树脂取膏状或固体花椒油树脂样品置于50℃水浴锅中溶解，摇匀。精密称取0.2g（精确至0.0001g）样品置于烧杯中，加甲醇50mL，超声萃取0.5h，冷却至室温，转移至100mL容瓶，甲醇定容，经0.2μm滤膜过滤，待测。7.3样品测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL,注入液相色谱质谱仪，按6.1、6.2仪器设备测定条件进行测定，即得花椒酰胺类麻味物质的保留时间和相应的质谱特征响应峰面积。由样品液的花椒酰胺类物质的特征峰面积，从标准曲线上查出相应的羟基-α-山椒素浓度。样品液的响应值应在仪器测定的线性范围之内，超出线性范围的供试样品液需用甲醇稀释后测定。7.4结果计算供试品中花椒麻酰胺类麻味物质含量以羟基-α-山椒素计，按公式（1）计算。……………………………….（1）式中：X——供试品中花椒酰胺类麻味物质含量，单位为毫克每克（mg/g）；C——供试品溶液中花椒麻素的峰面积对应的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——供试样品工作液定容体积，单位为毫升（mL）；K——供试样品工作液稀释倍数；m——供试品的称样量，单位为克（g）；结果保留小数点后2位。7.5精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。