【团体标准】 奶牛隐性乳房炎抗性分子标记检测技术规程

本文件规定了奶牛隐性乳房炎抗性分子标记检测的术语与定义及血液基因组DNA提取、基于KASP技术的PCR扩增、结果与分型等。适用于奶牛隐性乳房炎抗性分子标记检测。3.1生产性能测定奶牛亚临床乳房炎，又称隐性乳房炎，亚临床乳房炎主要特征是奶牛的乳房和乳汁异常变化，通常通过实验室方法检测到牛奶中炎症细胞（体细胞）的增加，乳汁中体细胞数超过50万/mL，则被确定为患有奶牛隐性乳房炎，其乳汁较健康奶牛的有显著差异，pH值、氯化钠、电导值等理化细菌数量远远高于正常乳汁。3.2KASP高通量分型技术竞争性等位基因特异PCR利用一种独特形式的竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，通过荧光报告系统，从核酸水平上识别和测量发生的遗传变异，进而检测单核昔酸多态性(SNPs)的插入或缺失(Indels)。4检测牛群样品采集4.1通过尾静脉采血，采集血液5mL，使用EDTA溶液抗凝5血液基因组DNA提取5.1参照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA5.2用紫外分光光度计和2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。6基于KASP技术的PCR扩增6.1PCR扩增体系(10L):KASP2×MasterMix4μL、DNA样品1μL、2个正向引物均为0.15μL、反向引物0.4μL，加ddH2O补至8μL。阴性对照反应中以等量ddH20代替DNA样品。(见附表1)。6.2KASP分子标记检测引物，见附表26.3PCR扩增反应条件(见附表3)。PCR扩增循环结束后，在室温下，利用酶标仪读取荧光值。7结果与分型利用LC480Softwarev1.5.1软件分析分型结果，用LGC公司SNPView软件展示。标记为黄色的基因型样品为HEX标记的等位基因是纯合的，标记为红色的基因型样品为FAM标记的等位基因是纯合的，标记为绿色的样品为杂合。