【团体标准】 液体菌种生产段木灵芝技术规程

液体菌种生产段木灵芝技术规程1范围本标准规定了液体菌种生产段木灵芝的术语和定义、基本要求、液体菌种制备、栽培技术、病虫害防治、档案管理等技术要求。本标准适用于液体菌种生产段木灵芝。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB3095环境空气质量标准GB5084农田灌溉水质标准GB5749生活饮用水卫生标准GB/T12728食用菌术语GB15618土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准GB/T29344灵芝孢子粉采收及加工技术规范NY/T528食用菌菌种生产技术规程NY/T5010无公害农产品种植业产地环境条件NY5099无公害食品食用菌栽培基质安全技术要求DB33/T985段木灵芝生产技术规程3术语和定义GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本标准。灵芝指多孔菌科灵芝属(Ganoderma)真菌的赤芝Ganodermalingzhi.或紫芝Ganodermasinense。段木料棒指段木经装袋、灭菌后的段木料袋。菌木棒指经接种后长有灵芝菌丝的段木料袋。空罐灭菌指对尚未加水投料的空发酵罐进行蒸汽灭菌。实罐灭菌指对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。摇瓶菌种指通过三角瓶等容器振荡培养的液体菌种。一级罐菌种指摇瓶菌种转接到发酵罐中用于扩大培养的液体菌种。二级罐菌种指一级罐菌种接入发酵罐培养并直接用于生产接种的液体菌种。4基本要求卫生要求4.1.1人员工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵、接种车间必须穿戴经灭菌处理的工作服、口罩、鞋、帽。4.1.2环境生产环境按NY/T528的要求。空气质量符合GB3095规定。土壤环境符合GB15618的规定。生产用水符合GB5749规定。灌溉用水符合GB5084规定。设施设备---宜配备培养基制作、发酵培养、灭菌、冷却、接种、培养贮存、段木加工与装袋等专用场所，大小匹配、布局合理。其中发酵培养、冷却、接种、培养贮存区具备空间温度、湿度控制系统。---应配有液体菌种培养器、液体菌种接种器、洁净空气系统、高压蒸汽灭菌系统、超净工作台、恒温回旋式振荡器、恒温培养箱、冰箱、显微镜、天平、酸度计等相关设施设备。5液体菌种制备工艺流程工艺流程见图1。图1灵芝液体菌种生产工艺流程菌种选择选择种性稳定，抗逆性强的灵芝栽培品种。母种按NY/T528要求生产。摇瓶菌种制备5.3.1培养基配方按1000mL计。配方一：葡萄糖20g，玉米粉3g，蛋白胨2g，豆粕10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g。配方二：葡萄糖20g，玉米粉10g，酵母粉5g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g。5.3.2灭菌培养基装入三角瓶中，装液量为1/4～1/3，封口后移至高压灭菌锅中，保持0.105Mpa～0.125Mpa压力下30min。5.3.3接种冷却至30℃以下，在无菌条件下接入母种。5.3.4培养在24℃～26℃、160r/min～180r/min条件下振荡培养7d～8d。5.3.5摇瓶菌种要求菌种外观澄清透明不浑浊，无杂菌、无异味；菌丝体密集、均匀悬浮于液体中不分层。一级罐和二级罐菌种制备5.4.1发酵罐清洗发酵罐使用前用水对罐体和管路进行清洗，并检查发酵罐阀门的密封性。5.4.2空罐灭菌在培养基装入前，应对罐体、管路、过滤器进行蒸汽灭菌，保持罐内0.105MPa～0.125Mpa压力下灭菌30min～40min。5.4.3培养基制备培养基原料应符合NY/T5099要求，按1000mL计。配方一：豆粉10g、玉米粉5g、蛋白胨2g、白糖8g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g。配方二：豆粉20g、蛋白胨2g、葡萄糖18g、硫酸铵2g、磷酸二氢钾1g、氯化钠2.5g。5.4.4实罐灭菌用水将配方原料搅拌均匀后加入罐体，装液量应小于罐体容积的70%，并加入液体培养基重量0.03%～0.05%的消泡剂，保持罐内0.105MPa～0.125Mpa蒸汽压力下灭菌90min，空气过滤器灭菌保持20min～30min，期间需进行间隙性排水。5.4.5接种待液体培养基冷却至28℃以下，一级菌种罐接种时，在火焰保护下接入摇瓶菌种，接种量为培养基重量的0.1%～0.3%；二级菌种罐接种时，由一级菌种罐通过管路接入二级菌种罐，接种量为培养基重量的5%～8%。5.4.6菌种培养在罐压0.02MPa～0.08MPa，温度24℃～27℃，培养5d～8d。前2天通气量0.5V/V·min～1.0V/V·min，中后期通气量1.0V/V·min～1.5V/V·min。5.4.7液体菌种检测感官要求感官指标符合表1的规定。表1灵芝液体罐菌种感官要求感官指标要求菌液色泽菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅棕色菌液形态菌液稍粘稠，有大量菌丝球或菌丝片段悬浮，分布均匀，不迅速分层，菌液不浑浊菌液气味有灵芝液体培养时特有的香气，无酸、臭等异味，发酵罐排气口气味正常，无明显改变显微镜下菌丝形态可见灵芝菌丝粗壮，分枝密度高，可见锁状联合，无杂菌霉菌检验按照无菌操作取样，将样液接种于PDA斜面或培养皿培养基上，于28℃恒温培养2d～5d，借助感官观察与显微镜观测菌丝生长状况和有无霉菌污染，必要时进行水封片镜检。细菌检验将样液接种于营养肉汤培养基中，于28℃恒温培养48h，观察培养基是否变浑浊带臭味。6栽培技术栽培季节宜在11月中下旬～翌年1月上旬制棒接种，3月下旬～4月下旬排场，5月下旬出芝。采收子实体的品种9月采收；采收孢子粉的品种，7月上旬套筒，9月下旬～10月上旬采收孢子粉和子实体。菌木棒制备6.2.1树种选择宜选择壳斗科的麻栎、青冈等阔叶树种，也可选择杜英科、金缕梅科等阔叶树种。6.2.2装袋将原木截成20cm～30cm的木段，剔去尖角和毛刺，装入折径宽30cm～36cm，长60cm～70cm，厚0.006cm～0.008cm的聚乙烯筒袋。每袋视段木粗细可装1根～5根段木，重量7.0kg～11kg。装段木时防止袋子破损。袋子两端扎绳，或一端密封、另一端扎绳。6.2.3灭菌段木料袋采用微压灭菌，温度快速上升至105℃～110℃，连续保温10h～12h。6.2.4接种当段木料棒温度冷却至28℃以下，在经臭氧或紫外消毒后的洁净室接种。用液体菌种接种器进行一端喷洒接种，每段接种量70mL～100mL，接种后扎紧袋口，放入培养室或发菌棚内培养。6.2.5发菌培养把接种后的段木料棒移入发菌室或发菌棚中，堆放层次不超过8层，中间留出50cm的通风道或采用培养架培养，控制菌木棒在22℃～25℃温度下培养。培养期间根据气温情况在早、中、晚通风1h～2h，空气湿度控制在60%～75%。培养14d～16d待菌丝发满整个菌木棒表面后停止加温，自然温度发菌（菌棒最高温不超过30℃），每天通风3次～4次，每次20min～30min。发现杂菌感染的菌木段要及时搬离。排场前19d～21d，培养室或发菌棚给予散射光。栽培场地选择选择地势开阔，通风排水良好，水源清洁充足的区域，环境水质、土壤符合NY/T5010的规定。场地整理6.4.1场地清理大田栽培在晴天深翻土20cm，去除杂草、碎石等杂物，日光暴晒1～2d后做畦。6.4.2做畦根据栽培场地的实际情况作成宽0.8m～1.0m，高25cm，沟宽25cm～30cm，沟深20cm～30cm的畦。菌棒下地前2d，畦面上撒生石灰，用量为100g～150g/m2，浇透水后备用。6.4.3搭拱棚畦床上根据栽培场地大小搭建高1.5m～2.2m或0.8m的拱棚，宽度根据场地调节，棚两端留门，拱棚上覆塑料膜、遮阳网。塑料膜采用聚乙烯塑料，厚度0.004cm，遮阳网遮阴度为70%～80%。排场覆土选择天晴、阴凉的天气把灵芝菌木棒运至场地，平放于栽培畦上，通风见光7d～12d，待菌丝表面有少量浅黄色菌皮形成后再脱去外袋，根据畦宽每畦卧倒横排2段～6段，菌木棒间距3cm～5cm，行距6cm～8cm。菌木棒上面盖2cm～3cm的新细土，填实棒间的空隙，覆土后在畦面上淋透水。出芝管理6.6.1通风在灵芝原基还未形成时，可用通风来调节棚内的温湿度；原基形成到幼芝生长期，应利用棚两端薄膜掀开方式通风；子实体开伞后卷起拱形棚两侧薄膜，加大通风量。6.6.2湿度菌蕾形成至开片时，空气湿度宜保持在90%～95%；子实体开片基本完成，菌盖边缘稍有黄色时，空气湿度宜保持在85%～90%；子实体趋于成熟至孢子弹射期，空气湿度宜保持在80%～85%。6.6.3温度用遮阳、喷水、掀盖膜等方法控制出芝场的温度，最适温度为20℃～30℃。6.6.4光照根据气温和日照情况，在盛夏高温强日照下增加遮阳，使棚内光照强度保持在七分阴三分阳，保持光照均匀。6.6.5疏芝用锋利小刀从基部割去过多芝芽，每根菌木棒保留1朵～2朵。疏芝原则为去弱留强，去密留疏。6.6.6孢子粉收集灵芝菌盖边缘黄色生长圈消失后即可开始采集，方法符合GB/T29344相关规定。6.6.7采收后管理采收后及时清理栽培场，对外露的菌段用泥土覆盖保护，厚度2cm以上，四周挖深排水沟。翌年按6.6的规定再管理1次。7病虫害防治预防为主、综合防治的原则，参照DB33/T985的规定执行。8档案管理摇瓶液体菌种、一级罐菌种、二级罐菌种生产和接种各环节操作内容，出芝管理中的主要工作参数及时间节点等信息，由技术人员现场详细记录，签字后归档保存。保存期2年。