【团体标准】 骨修复材料体外成骨性能评价方法

1要求本试验利用三维骨组织模型评价骨修复材料的成骨性能。对骨修复材料的成骨性能定量评估，具体指标包括：a)矿化能力：应能促进钙结节形成，试验组的茜素红染色定量结果应不低于阳性对照组；b)成骨相关蛋白表达：试验组的启动成骨分化的Runt相关转录因子2（Runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）、调控骨矿化的成骨细胞特异性转录因子Osterix（OSX）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OC）表达应不低于阳性对照组。2试验方法三维骨组织模型制备2.1.1细胞系选用小鼠成骨前体细胞系[如来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1]，具有成骨诱导后形成成骨细胞的能力。2.1.2培养基完全培养基：含有10v/v%胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）的DMEM（Dulbecco'smodifiedeaglemedium）培养基，内含1v/v%青链霉素，用于细胞生长。成膜培养基：用于细胞成膜培养。2.1.3制备方法细胞薄膜培养辅助环制备利用双组份食品级硅胶制备细胞薄膜培养辅助环。将硅胶双组份按1:1混合均匀，使用真空泵除去硅胶中的气泡后，将硅胶浇筑于内径为15.5mm，外径为28mm，高度为8mm的环形模具中，应使硅胶填充至与环形模具边缘平齐，在记录中注明模具的材质。再次使用真空泵除去硅胶中的气泡，70℃的烘箱中交联24h，脱模具，获得细胞薄膜培养辅助环。辅助环一面平整光滑以保证可以紧贴培养皿。注：合适的惰性模具材料可以是聚甲基丙烯酸甲酯或聚四氟乙烯。三维骨组织模型制备该步骤应在超净工作台中进行。裁剪直径5mm的圆形封口膜，灭菌后将其贴于35mm细胞培养皿的正中间，再将灭菌后的细胞薄膜培养辅助环放在培养皿上，保证封口膜在其环形中央位置。用成膜培养基配制成4×105-8×105细胞/mL细胞悬液，每个辅助环内加入0.5mL细胞悬液，培养4-8天，每48h换液一次，促进细胞成膜。取下辅助环，然后沿侧壁使用1mL移液枪轻轻吹打细胞薄膜边缘，使其剥离，获得中间带孔（直径5mm的圆形孔）的细胞薄膜；将剥离的细胞薄膜用5ml移液管转移到35mm细胞培养皿中，吸干周围的培养基，于37℃±0.25℃，5%±0.15%CO2，95%±5%相对湿度的CO2培养箱中放置30min，使细胞薄膜粘接到培养皿上。将第二片剥离的细胞薄膜通过移液管转移到第一片之上，铺展并重叠，吸干周围的培养基，上述同样条件放置30min，使两片细胞薄膜充分粘接。重复以上操作，堆叠三层中间带孔的细胞薄膜，获得中间带有圆形孔缺损的三层细胞薄膜组织，构建三维骨组织模型。注：常用的实验室封口膜即可，提前通过紫外线或酒精对封口膜以及辅助环灭菌。测试方法2.2.1样品准备样品应无菌，参照YY/T0127.9制备样品。——支架：制成直径约5mm的圆形试样，厚度2mm。——颗粒：将材料填入内径5mm，高2mm的环形模具中。在记录中注明模具的材质。应在填入材料之前将环形模具置于三维骨组织模型的中间缺损处，成型后移除。2.2.2空白组培养基。2.2.3空白对照组三维骨组织模型和培养基。2.2.4阳性对照组三维骨组织模型、培养基和阳性对照材料。2.2.5阴性对照组三维骨组织模型、培养基和阴性对照材料。2.2.6试验组三维骨组织模型、培养基和试验材料。2.2.7材料细胞毒性测试将试验骨修复材料置于三维骨组织模型的中间缺损处。为防止材料在加入培养基后离散，其上覆盖商用胶原膜，加入1-2mL培养基于37℃±0.25℃，5%±0.15%CO2，95%±5%相对湿度的CO2培养箱中培养。在12h、24h、48h三个时间点，使用移液器向每样中加入100μLCCK-8溶液，于37℃±0.25℃，5%±0.15%CO2，95%±5%相对湿度的CO2培养箱中孵育3.5h。每样取120μL加入到96孔板中，至少3个复孔。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。参照GB/T16886.5，细胞存活率低于70%被认为有细胞毒性反应，因此该材料不适宜进行后续的成骨性能测试。2.2.8材料成骨性能测试成骨诱导将试验骨修复材料置于三维骨组织模型的中间缺损处。为防止材料在加入培养基后离散，其上覆盖商用胶原膜，加入1-2mL成骨诱导培养基，于37℃±0.25℃，5%±0.15%CO2，95%±5%相对湿度的CO2培养箱中培养28天，每48h换液一次。茜素红染色在培养第28天，进行茜素红S染色以及定量。将贴壁混合细胞使用磷酸缓冲盐溶液（Phosphatebufferedsaline,PBS）清洗3次，加入固定液覆盖细胞固定30min。吸去固定液，PBS清洗3次，滴加茜素红S染液，覆盖样品，于室温下染色30min。吸去茜素红S染液，蒸馏水清洗3次，晾干，显微镜下观察成骨细胞矿化结节中的钙质染色。进一步对钙质进行定量，每个培养皿中加入1mL的10%溴代十六烷基吡啶摇床上轻摇1h以结合茜素红，洗脱好的溴代十六烷基吡啶移入EP管中，用10%溴代十六烷基吡啶稀释20倍，用于测定。酶标仪测定波长562nm吸光度。Westernblot法检测成骨相关蛋白在培养第14天和28天提取组织总蛋白，通过westernblot法检测成骨相关蛋白，包括Runx2、OSX、OPN、OC。配制10%分离胶，配制5%浓缩胶。随后用SDS-PAGE对各组蛋白质进行分离，根据蛋白浓度计算上样量，一般为20μg，可适量加至40μg。在电泳槽中加入已经配置混合均匀的电泳缓冲液，在1-2个泳道中加入3μL蛋白分子量标准，其余每个泳道加入已制备好的蛋白样品。首先在86伏电压下电泳至样品驶出浓缩胶，然后调整至200伏电压继续电泳，直至目标条带充分分离。转膜步骤完成后，使用5%脱脂奶粉溶液在室温条件下封闭1h。将对应的一抗溶液滴加至聚偏二氟乙烯膜表面，于室温环境孵育1-2h。随后加入经脱脂奶粉稀释的二抗溶液，室温孵育1-2h。所有步骤完成后即可在化学发光成像系统上进行显影检测。